在一些微生物實(shí)驗(yàn)室或者需要無菌操作的場所，想了解滅菌的具體效果就需要生物指示物的幫助。通常滅菌指的是用物理或化學(xué)的方式將目標(biāo)微生物全部殺滅，使之達(dá)到無菌保障水平，一般最常用的有化學(xué)試劑、射線、濕熱、干熱以及過濾等除菌手段。針對不同的微生物采用的方法也不一樣。而想要驗(yàn)證這些方法的效果，就需要一些具有滅菌耐受力的活微生物作為指示物來進(jìn)行判斷。

  今天我們要講的枯草芽孢桿菌黑色變種主要用于各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)及制藥工業(yè)領(lǐng)域的消毒效果驗(yàn)證中，其原理是經(jīng)過滅菌處置后含有枯草芽孢桿菌黑色變種的水樣在通過孔徑為0.45um的濾膜后，細(xì)菌和芽孢被截留在濾膜上，然后將濾膜置于酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，36℃±1℃培養(yǎng)72h-96h，枯草芽孢桿菌黑色變種產(chǎn)生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，產(chǎn)生黑色的特征菌落。對特征菌落進(jìn)行染色鏡檢后通過生化試驗(yàn)做進(jìn)一步鑒定，能利用甘油和甘露糖，可還原硝酸鹽和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并確認(rèn)為革蘭氏陽性芽孢桿菌的特征菌落為枯草芽孢桿菌黑色變種，鑒定結(jié)果為陽性。

佛山在線氨氮監(jiān)測儀

檢測所用試劑

1.酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基。

2.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

3.淀粉培養(yǎng)基和碘液。

4.硝酸鹽還原培養(yǎng)基和相關(guān)試劑。

5.甘油復(fù)紅肉湯培養(yǎng)基。

6.甘露糖生化培養(yǎng)基。

7.甘露醇生化培養(yǎng)基。

8.苦杏仁苷生化培養(yǎng)基。

9.革蘭氏染色液。

10.芽孢染色液。

11.陰性對照菌：如地衣芽孢桿菌。

12.陽性對照菌：枯草芽孢桿菌黑色變種。

13.枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液

按照《消毒技術(shù)規(guī)范》的規(guī)定制備，也可購買濃度范圍在106CFU/ml-109CFU/ml之間的市售枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液。

14.無菌濾膜：直徑50mm，孔徑0.45μm的醋酸纖維濾膜。

按無菌操作要求包扎，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，晾干備用；或?qū)V膜放入燒杯中，加入實(shí)驗(yàn)用水，煮沸滅菌3次，15min/次，前2次煮沸后需換水洗滌2-3次。也可采用市售的無菌濾膜。

15.石蠟質(zhì)封口膜。

16.無菌水：取適量實(shí)驗(yàn)級純水，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

檢測所需試劑

1.樣品瓶：螺口帶蓋或磨口具塞的250ml、500ml廣口玻璃瓶。

2.恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。

3.高壓蒸汽滅菌器：121℃，可調(diào)。

4.pH計(jì)：準(zhǔn)確到0.1pH單位或更高精度。也可使用pH精密試紙。

5.顯微鏡：物鏡4×或5×、10×、20×、40×，油鏡100×，目鏡10×或15×。

6.分析天平：實(shí)際分度值0.0001g。

7.培養(yǎng)皿：直徑90mm。

8.過濾裝置：配有砂芯濾器、圓筒形玻璃漏斗和真空泵，抽濾壓力不低于-50kPa。

9.接種環(huán)：直徑1mm-3mm。

10.鑷子：不銹鋼或一次性無菌塑料鑷子。

11.刻度移液管：1ml、10ml。也可使用可調(diào)式移液器。

12.量筒：100ml。

13.錐形瓶：100ml。

14.酒精燈。

15.試管：10ml。

16.無菌操作設(shè)備：無菌室、超凈工作臺、生物安全柜。

17.一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

水樣采集

  評價使用高溫高壓滅菌設(shè)備的滅菌效果時，取樣品瓶，加入枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液及200ml無菌水使混合液中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達(dá)到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。滅菌處置完畢后，取出樣品瓶，對水樣進(jìn)行滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的檢測。

  評價使用其它滅菌設(shè)備的滅菌效果時，滅菌前取適量枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢懸液加入滅菌設(shè)備，使水樣中枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢終濃度達(dá)到5×104CFU/ml-5×105CFU/ml。滅菌處置完畢后，從滅菌設(shè)備中采集水樣，進(jìn)行滅菌生物指示物（枯草芽孢桿菌黑色變種）的檢測。采樣量一般為樣品瓶容量的80%左右，不得用樣品洗滌樣品瓶。樣品采集完畢后，迅速用無菌包裝紙包扎樣品瓶。

  樣品采集后宜在2h內(nèi)檢測，否則應(yīng)在10℃以下冷藏保存運(yùn)輸，但不得超過6h。實(shí)驗(yàn)室接收樣品后，不能立即開展檢測的，樣品應(yīng)在4℃以下冷藏保存，并在2h內(nèi)檢測。

水樣過濾

  用無菌鑷子以無菌操作夾取無菌濾膜貼放在已滅菌的過濾裝置上，固定好過濾裝置。將樣品充分混勻后取100 ml 抽濾，以無菌水沖洗濾器內(nèi)壁2-3 次。樣品過濾完成后，再抽氣約5s，關(guān)上開關(guān)。過濾前按照無菌操作要求調(diào)節(jié)樣品的pH值至7.0-8.0。

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